一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用

发布时间：2017-10-24

专利名称：一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用

申请类型：发明专利申请

著录项展示

申请号：CN201510002644.9

申请日：20150105

公开（公告）号：CN104531597A

公开日：20150422

申请（专利权）人：江南大学;江苏汉光生物工程有限公司

发明人：陈坚;堵国成;康振;张传志;顾汉章;徐堃

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/77;C12P13/22;C12R1/15

地址：江苏省无锡市蠡湖大道1800号

国省代码：江苏(32)

优先权：20140922 CN2014104878994

代理机构：北京爱普纳杰专利代理事务所（特殊普通合伙）

摘要

本发明公开了一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用，属于代谢工程领域。本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株Corynebacterium?glutamcium?ATCC?13032中，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的两个穿梭表达载体pEC-XK99E和pXMJ19表达L-Phe合成途径中八个关键酶基因：aroFfbr，tktA，ppsA，aroL，pheAfbr，aroE，aroA，tyrB，并通过使用两个不同强度的启动子Ptac和Plac对八个基因进行组合表达提高L-Phe产量，L-Phe产量最高达到5.59±0.11g/L，莽草酸积累为0.31±0.11g/L。本发明提供了一种通过过量表达L-Phe合成途径关键酶基因，提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-Phe的方法。
 

说明书

技术领域

本发明涉及一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建与应用，属于代谢工程领域。

背景技术

苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)，即D.L-α-氨基-β-苯基丙酸，是一种芳香族杂环、非极性、电中性的氨基酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phe)，比旋光度为-35.1°。L-Phe在生物体内可被辅酶四氢生物喋呤不可逆地转化为L-酪氨酸(L-Tyrosine，L-Tyr)，后继续分解，经转氨基生成少量苯丙酮酸。L-Phe广泛存在于自然界中，是人体和动物所必须的8种氨基酸之一，而D-Phe在自然界中并不存在，只有通过合成的方法获得。

L-Phe的生产技术主要包括天然蛋白质水解法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中天然蛋白质水解法由于其生产工艺相对复杂，产品质量不稳定，难以用于工业化生产。化学合成法因其生产路线长、副产物多且产物为消旋不宜推广使用等缺点，因而逐渐被淘汰。由于酶法具有生产工艺简单、产物浓度高、纯化步骤简单等特点是目前工业化L-Phe的主要生产方式之一，微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小，产物浓度高等优点成为国内外工业化生产L-Phe的主要方法。

谷氨酸棒杆菌中L-Phe合成途径主要分为三个部分：1、中心碳源代谢途径提供两个前体物质，来源于糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate,PEP)以及来源于磷酸戊糖途径的4-磷酸-赤藓糖(Erythrose-4-phosphate,E4P)；2、莽草酸途径是芳香族氨基酸合成的共同代谢途径；3、分支酸路径，以分支酸(Chorismate)为节点通过不同的酶作用分别流向三种不同的芳香族氨基酸L-Phe，L-酪氨酸和L-色氨酸。

虽然大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸能到很高的水平，但大肠杆菌由于其自身的特点而在大工业化生产中受到了限制，尤其在制备食品级的大工业化生产中。这是因为大肠杆菌本身是一种条件致病菌，所生产的重组蛋白、有机酸等产物中残留有大肠杆菌的相关抗原，从而易引起人或其他动物的免疫反应，这是公众卫生所不能接受的；此外，大肠杆菌是一种很好的噬菌体宿主菌，在大工业化发酵生产中极易遭受噬菌体的感染。

谷氨酸棒杆菌是一种食品级的微生物，本发明旨在提供一种L-苯丙氨酸产量提高的重组谷氨酸棒状杆菌。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，是在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中过量表达了八个L-Phe合成途径的八个关键酶基因：aroFfbr(3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶)，aroE(莽草酸脱氢酶)，ppsA(磷酸烯醇式丙酮酸合成酶)、tktA(转酮酶)、pheAfbr(双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)，aroA(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)，tyrB(氨基转移酶)和aroL(莽草酸激酶)。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。

在本发明的一种实施方式中，aroFfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，aroE的核苷酸序列如Gene ID:3343183所示，ppsA的核苷酸序列如Gene ID:14791674所示，tktA的核苷酸序列如Gene ID:3343601所示，pheAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，aroA的核苷酸序列如Gene ID:3345010，tyrB的核苷酸序列如Gene ID:12933673所示，aroL的核苷酸序列如Gene ID:12930837所示。

在本发明的一种实施方式中，aroFfbr，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转化谷氨酸棒状杆菌；pheAfbr，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的另一种实施方式中，aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL，简写为pSDTL。

所述启动子Ptac由Trp启动子和Plac启动子杂合而成，受IPTG诱导，具有更高的转录效率。

所述启动子Plac受IPTG诱导，其强度约为Ptac启动子强度的1/11。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌的方法，是将aroFfbr、aroE、ppsA、tktA连接到一个表达载体，将pheAfbr、aroA、tyrB和aroL连接到一个表达载体，共同转化谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一种实施方式中，aroFfbr，aroE，ppsA和tktA与pEC-XK99E连接后转化谷氨酸棒状杆菌；pheAfbr，aroA，tyrB和aroL与pXMJ19连接后转化谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的另一种实施方式中，aroFfbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroFfbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroFfbr-aroE-Plac-ppsA-tktA，简写为pSUTL；pheAfbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheAfbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheAfbr-aroA-Plac-tyrB-aroL，简写为pSDTL。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-Phe的方法，是将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200-300r/min)上，30℃发酵培养60-80h。

种子活化培养基(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，葡萄糖5.0，装液量20mL/250mL。

种子活化培养基(LBG固体)(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，营养琼脂15.0～20.0。

发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆干粉17.5，硫酸铵5.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，尿素2.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。装液量20mL/250mL。

谷氨酸棒杆菌培养基根据需要添加对应的抗生素：氯霉素(17mg/L)；硫酸卡那霉素(25 mg/L)，IPTG添加量终浓度为1.0mM，发酵诱导时间为0h诱导。

种子培养：接种一环LBG平板种子于发酵种子培养基，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃培养18h。

发酵培养：按10％接种量将种子培养基接入发酵培养基中，同时加入1.0mM IPTG诱导质粒表达重组酶，置于巡回式摇床(200r/min)上，30℃发酵培养72h。

本发明的有益效果：本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamiucm ATCC 13032中，采用两个质粒pEC-XK99E和pXMJ19对L-Phe合成途径不同来源的八个关键酶基因(aroFfbr，tktA，ppsA，aroL，pheAfbr，aroE，aroA，tyrB)结合两个启动子Ptac和Plac进行调控表达，通过理性的改造提高谷氨酸棒状杆菌模式菌株ATCC 13032中L-Phe产量，获得了一株重组谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)，最终通过诱导表达C.glutamicum(pSUTL,pSDTL)L-Phe产量最高为5.59±0.11g/L，莽草酸积累为0.31±0.11g/L，出发菌株ATCC 13032 L-Phe产量为0.16±0.05g/L，莽草酸为0.29±0.02g/L，结果表明可以通过代谢工程的手段过量表达L-Phe合成代谢途径中的关键酶基因并结合调控表达的策略，构建出L-Phe的产生菌株，同时可以应用于提高L-Phe产生菌株L-Phe的产量。

编辑：冰亚@北京爱普纳杰专利代理机构

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