发明专利案例：一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法

发布时间：2020-03-24

专利名称：一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法

专利类型：发明专利申报

摘要：

本发明公开了一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程技术领域。本发明提供的阿魏酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，分子量为112KDa，晶体结构由8个不对称单体组成，其中单体A(1)和单体H(8)组成二聚体、单体B(2)与单体F(6)组成二聚体、单体C(3)和单体E(5)组成二聚体、单体D(4)与其不对称伴侣组成二聚体、单体G(7)与其不对称伴侣组成二聚体，晶胞参数为本发明所提供的阿魏酸脱羧酶的结构信息可用于提高苯乙烯产量、提高酶活性、改变底物特异性、提高酶pH和热稳定性、构建阿魏酸脱羧酶突变体库、生产反式肉桂酸相似体、去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积累等方面。

权利要求：

1.一种阿魏酸脱羧酶的晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为：单体A(1)、单体B(2)、单体C(3)、单体D(4)、单体E(5)、单体F(6)、单体G(7)和单体H(8)；含有一个3-羟基肉桂酸配体；

晶体结构参数为：

空间群C121；

晶胞参数

所述单体的多肽链折叠成一个三结构域结构，N端部分的结构是由名称为N端第一结构域和N端第二结构域的两个结构域构成，C端结构域是由一个侧面的α-螺旋结构组成；N端第一结构域是由四个绳状结构，三个螺旋和一个310-螺旋组成；N端第二结构域，即中间结构域，主要由β-结构元素构成，包含7个β-折叠，8个反平行β-折叠；C端结构域与中间结构域相连，连接部分的核心由5个β-折叠及两侧面的两个α-螺旋构成；

所述阿魏酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；

所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中单体A(1)和单体H(8)组成二聚体、单体B(2)与单体F(6)组成二聚体、单体C(3)和单体E(5)组成二聚体、单体D(4)与其不对称伴侣组成二聚体、单体G(7)与其不对称伴侣组成二聚体；

所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中，单体B(2)和单体F(6)组成的二聚体是通过两个α-螺旋中的氨基酸残基的相互作用来维持，通过盐桥和疏水相互作用调节结构。

2.权利要求1所述晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶分子量为112KDa。

3.权利要求1所述晶体结构的解析方法，其特征在于，是利用冷冻液氮从培养液中结晶出单一晶体，通过X射线源获取的晶体数据。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据；

2)晶体结构可借助于基于假定芳香酸脱羧酶结构的相位器和I-TASSER模型利用分子替代法定向；其中假定芳香酸脱羧酶是指PDB：4IWS；

3)根据Matthew参数，一个不对称单位中含有八个单体，相位器中的溶液的最高LLG为497.9，最高TFZ为28.7，Rcryst为55.9％；利用Phenix和COOT软件对结构数据进行修正，获得Rcryst因子达到36.3％，Rfree因子达到46.4％的模型；

4)初始相关模型单体可用于获得MR的第二数据集合，同时，在不对称单位中发现八个蛋白质单体，初始模型可以根据步骤3)所述方法进行数据修正，结构模型可以通过TLSMotionDeterminationServer分析，再利用eightTLSgroups进行数据细化，获得一个Rcryst因子为17.4％，Rfree因子为23.0％的模型，利用CCP4程序SFCHECK和PROCHECK对最终模型进行检查。

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