发明专利案例:一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用
发布时间:2020-03-24专利名称:一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用
专利类型:发明专利申报
摘要:
本发明公开了一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用,通过基因工程技术,将来源于G.oxydans的pqqA及pqqABCDE基因,分别表达于本实验室构建的由山梨醇生产2-KLG的G.oxydans一步工程菌中,解除小菌对伴生菌依赖的问题,实现了从D-山梨醇到2-KLG的直接转化,简化了维生素C生产工艺,为了进一步提高2-KLG的产量,将PQQ合成的关键基因pqqA及基因簇pqqABCDE分别表达于G.oxydans一步工程菌中,2-KLG的产量最高可达51.8g/L,较未表达PQQ的一步工程菌提高了60%。
权利要求:
1.一种提高2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)工程菌,其特征在于将pqqABCDE,或pqqA及pqqABCDE同时表达于G. oxydans一步工程菌中,所述G. oxydans一步菌中表达质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh,工程菌的构建过程如下:
对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh通过连接肽GGGGS融合后连接到pMD19-T测序,同时将来源于G. oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19-T测序,获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1,得到重组质粒载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh;
再将K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的pqqA及pqqABCDE,分别获得基因,连接到克隆载体pMD19-T测序,获得正确的转化子后进行双酶切连接到质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh上,构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE,将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109,菌落PCR验证阳性转化子;再将来源于G. oxydans WSH-003的tufB启动子序列扩增后克隆到pMD19-T测序,获得正确的转化子后双酶切连接到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE,构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE,转化E.coli JM109后菌落PCR验证阳性转化子,再通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G. oxydans WSH-003中;
所述pqqA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1,所述pqqABCDE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述基因工程菌在生产2-KLG中的应用。
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