一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用-发明专利
发布时间：2017-10-19专利名称：一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用
专利申请号：CN201410617873.7
专利申请人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
专利发明人：咸漠;刘炜;田宁;程涛
专利申请类型：发明专利申请
专利申请代理机构：北京爱普纳杰专利代理事务所
专利摘要：本发明公开了一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是在含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp。其中，基因工程菌可共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及异戊二烯合成酶或异戊二烯衍生物合成酶。利用本发明所提供的方法可大幅提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物的产量，其中异戊二烯产量的提高了80.7%，异戊二烯衍生物香叶醇、桧烯和蒎烯产量分别提高了1.5倍、9倍和1.2倍。
专利说明书：
技术领域
本发明涉及一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用，属于基因工程 技术领域。
背景技术
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单 体。此外，还可广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要 是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙 烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石 油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成 异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。
目前，生物基异戊二烯的生物合成路线主要是以葡萄糖为原料，利用甲羟戊酸(MVA) 或甲基赤藓糖-5-磷酸(MEP)途径合成异戊二烯。其中，MVA途径因效率较高，是目前异 戊二烯生物合成的主要途径。然而，与MEP途径相比，MVA的产率较低。
其主要原因是1分子葡萄糖经过糖酵解途径生成2分子乙酰辅酶A，同时会产生2分子 二氧化碳。I.W.,Bogorad等人(2013)提出细胞除了在有氧的条件存在糖酵解途径(MEP途 径)以外，在厌氧条件下还存在一条非氧化的糖酵解途径(NOG途径)，该途径可将1分子 葡萄糖转化为3分子乙酰磷酸，进而合成3分子乙酰辅酶A。该研究在体外构建了NOG途径， 并证明以葡萄糖6磷酸为底物，利用NOG途径可提高乙酸(乙酰磷酸的下游产物)的产量， 同时，在细胞体内，以木糖为原料，通过过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷酸酶 基因(fbp)并敲除乳酸脱氢酶(ldhA)、frdBC、adhE、pflB和frdBC后，可以使乙酸的摩 尔产率达到2.2接近利用NOG途径的乙酸理论摩尔产率2.5。虽然该研究证明了NOG途径的 可行性，然而，该研究并没有以葡萄糖为底物，在体内利用NOG途径合成异戊二烯及其衍 生物的研究。葡萄糖降解所需的磷酸葡萄糖转移酶系统(PTS)涉及到复杂的调控机制，NOG 途径是否适合以葡萄糖为原料的体内代谢无法得知。此外，该研究仅报道了乙酸的变化，乙 酰磷酸合成乙酸仅为一步反应，而从乙酰磷酸合成乙酰辅酶A，再由乙酰辅酶A为底物合成 异戊二烯及其衍生物却需要经过7步酶反应，过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷 酸酶基因(fbp)是否适用于如此复杂的代谢途
本发明为了解决异戊二烯及其衍生物生物合成过程中存在碳损失、产率低的瓶颈问题， 提供了一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法，采取的技术方案如下：
本发明的一个目的在于提供一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法，该方 法是在含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖 1,6-二磷酸酶基因fbp。
所述含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌，是共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟 甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟 戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及以下 任意一种基因的基因工程菌：
1)异戊二烯合成酶基因；
2)异戊二烯衍生物合成酶基因。
所述异戊二烯衍生物合成酶基因，是香叶醇合成酶基因、桧烯合成酶基因、蒎烯合成酶 基因、甲羟戊酸合成酶基因或橙花醇合成酶基因。
所述基因工程菌，优选敲除了乙酸激酶基因ackA、D-乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱 氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐还原酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC 的大肠杆菌的大肠杆菌。
所述磷酸转酮酶基因fxpk，优选来自青春双歧杆菌，GeneBank登录号为AY518212.1，或 者来自凝结芽孢杆菌Gene ID为11174923；或者来自蒙氏肠球菌Gene ID为17696722；
所述果糖1，6-二磷酸酶基因fbp，优选来自大肠杆菌，GeneBank登录号为ACT 45889.1； 或者来自酿酒酵母，GeneBank登录号为AAA34603.1；或者来自枯草芽孢杆菌，NCBI参考序 列号为WP_003243329.1；或来自拟南芥，GeneBank登录号为AEE79180.1。
所述方法的步骤如下：
1)构建含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰 辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶 基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及异戊二烯合成酶基因或异戊二烯衍生物合成酶基因的 MVA途径上下游重组质粒；
2)构建含有磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因fbp的重组质粒；
3)将步骤1)和步骤2)所得的重组质粒导入到宿主菌中，过表达磷酸转酮酶基因fxpk和 果糖1，6-二磷酸酶基因fbp。
步骤1)所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和3-羟-3-甲基戊二酰 辅酶A合酶基因来自于粪肠球菌；所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟 戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因来自于酿酒酵母。
所述方法的具体步骤如下：
1)将乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因和异戊二烯合成酶基因克隆到质粒pACYCDuet-1上，获得MVA途径上游质粒 pACY-mvaE-mvaS-isps4；
所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因来自于粪肠球菌Enterococcus faecalis；
2)将甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、 异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到pTrcHis2B，获得MVA途径下游质粒pTrc_low；
所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异 戊烯焦磷酸异构酶基因来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae；
3)将磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp克隆到质粒pCOLADUet-1上，获得 重组质粒pCOLA-fbp-fxpk；
4)将步骤1)、步骤2)和步骤3)所得的质粒导入到敲除了乙酸激酶基因ackA、D-乳酸 脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐还原 酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC的大肠杆菌中进行共表达。
所述方法用于生产异戊二烯及其衍生物。
本发明的另一目的是提供了一种利用所述方法生产异戊二烯及其衍生物的方法，该方法 的步骤如下：
1)将乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因以及异戊二烯合成酶基因或异戊二烯衍生物合成酶基因克隆到质粒上，构建MVA途 径上游质粒；
2)将甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、 异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到质粒上，构建MVA途径下游质粒；
3)将磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp克隆到质粒pCOLADUet-1上，构建 重组质粒pCOLA-fbp-fxpk；
4)将步骤1)、步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到敲除了乙酸激酶基因ackA、D- 乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐 还原酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC的大肠杆菌中，获得重组菌；
5)发酵步骤4)所得重组菌，分离提取发酵产物中的异戊二烯或异戊二烯衍生物。
本发明获得的有益效果如下：
本发明针对异戊二烯及其衍生物生物合成过程中存在碳损失、产率低的瓶颈问题，在含 有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸 酶基因fbp，构建了一条新的异戊二烯合成途径，大幅提高了基因工程菌的异戊二烯及其衍生 物的产量。其中异戊二烯产量的提高了80.7％，异戊二烯衍生物香叶醇、桧烯和蒎烯的产量分 别提高了1.5倍、9倍和1.2倍。
编辑：冰亚@北京爱普纳杰专利代理机构
来源：纳杰微信公众号（najieip）
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